Le contenu de cette page nécessite une version plus récente d’Adobe Flash Player.

Obtenir le lecteur Adobe Flash

 
ACTIVITES TECHNOLOGIQUES DE VIROLOGIE
CYTOCULTURE
Accueil diaporamas milieux d'isolement examens microscopiques métabolismes produits pathologiques systématique bactérienne virologie mycologie antibiogramme sécurité
   
 

Rechercher sur le site

Rappel: les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires. Leur étude peut nécessiter la culture de cellules (= cytoculture).

Ces activités technologiques ont pour but:

  • La réalisation des techniques de culture des cellules eucaryotes (cytoculture): trypsinisation, repiquage, entretien.
  • L'apprentissage du diagnostic virologique par étude des effets cytopathogènes, observation de lames d'immunofluorescence...

1. LES BONNES PRATIQUES DE LABORATOIRE

Document

2. TRYPSINISATION ET REPIQUAGE DES CELLULES

2.1. Matériel et milieu utilisés

Les cellules sont cultivées dans des flacons de culture (boîtes ou flask) de 25 ou 75 cm2 de surface, en plastique, contenant un milieu de culture (MEM=Minimum Essential Medium + 10% de sérum de veau foetal + glutamine + antibiotiques + antifongique). Elles adhèrent au fond de la boîte grâce :

    • au traitement spécial du plastique qui permet la formation d'un tapis cellulaire (monocouche)
    • à la fibrinolectine présente dans le sérum de veau fœtal.
  • Boîtes pour cytoculture

  • Milieu de culture

C’est un milieu synthétique dont la composition est la suivante :

 

 

Constituants

Rôles

MEM
(Minimum Essential Medium)

Sels minéraux

Maintien de l’isotonicité du milieu

Glucose

Source de carbone et d’énergie

Acides aminés essentiels
et non essentiels

Source d’azote et facteurs de croissance

Vitamines

Facteurs de croissance

Bicarbonate de sodium

Tampon

Rouge de phénol

Indicateur coloré de pH révélant la culture de champignons ou bactéries

Additifs

 

Sérum de veau fœtal (SVF)

Apporte :
-facteurs de croissance
-fibrinolectine qui permet l’ancrage des cellules au flacon
-des éléments tampon.

L-glutamine

Facteur de croissance

Antibiotiques (pénicilline G et streptomycine)

Evitent la contamination bactérienne

Antifongique (fungizone ou amphotéricine B)

Evite la contamination fongique

2.2. Principe

Dès que le tapis a recouvert toute la surface disponible, les cellules arrêtent leur multiplication, se décollent et meurent. Il faut donc traiter le tapis avant ce stade de manière à obtenir une suspension cellulaire capable de" repartir" dans un milieu neuf.

La trypsinisation (ou trypsination) a pour but de décoller les cellules adhérentes au flacon de culture: la trypsine (enzyme protéolytique) détruit certaines protéines de liaison et brise ainsi les liens entre les cellules, sans les altérer. Les cellules sont remises en culture dans du milieu neuf, elles sédimentent, se fixent sur la face traitée du flacon et se multiplient jusqu'à former un tapis continu (cellules confluentes).

2.3. Lignées cellulaires utilisées pour les activités technologiques

  • Cellules MRC5: cellules de poumons d'embryons humains, de type fibroblastique, dont le nombre de repiquages est limité (maximum 42 à 46 passages), préparées par bioMérieux
  • Cellules MDCK: cellules de rein de chien (Epagneul), de type épithélial, dont le nombre de repiquages est illimité (lignée continue)

Elles sont présentées en petites boîtes de 25 cm2, étiquetées:

  • nom de la lignée cellulaire
  • date du dernier repiquage.

2.4. Manipulation

            2.4.1. Observation des cellules MRC5 et MDCK au microscope inversé 

  • Le microscope inversé

Le trajet des rayons lumineux est inversé du fait de la permutation de la position du revolver et du condensateur sur l'axe optique. Ce type de microscope permet d'examiner des préparations dans tous les récipients usuels.

Microscope inversé

Observer le tapis cellulaire au microscope inversé (objectif x10 en lumière normale puis en contraste de phase pour une observation optimale) et conclure sur le type cellulaire (compléter le paragraphe 2.3.) sachant que :

  • Type fibroblastique: cellules en fuseau ou de forme irrégulière qui forment des fibres.

TYPE FIBROBLASTIQUE

Photo

Schéma

  objectif x10

  • Type épithélial (épithéloïde) : cellules formant un tapis qui ressemble à une mosaïque (contour polygonal).

TYPE EPITHELIAL

Photo

Schéma

  objectif x10

                        2.4.2. Trypsinisation d’une culture de cellules (MRC5 et MDCK)

  • Rejeter le milieu de culture de la boîte en tapis continu dans le pot à Javel.
  • Rincer 2 fois la nappe cellulaire à l'aide d'une solution saline équilibrée (solution de Hanks ou RPMI) réchauffée à température ambiante. Cette étape élimine toute trace de sérum de veau qui est un puissant inhibiteur de la trypsine.
  • Ajouter la trypsine à 0,25%, tiédie de préférence, en quantité suffisante pour recouvrir le tapis cellulaire.
  • L'étaler sur toute la surface du tapis, laisser quelques minutes en contact.
  • Rejeter la trypsine dans le pot à Javel.
  • Incuber la boîte quelques minutes à 37°C (entre 5 et 15 minutes).
  • Surveiller la trypsinisation: le tapis cellulaire se décroche en lambeaux (observation en tenant le flacon face à la lumière).
  • Observation des cellules au microscope inversé : « billes » = cellules décollées

                        2.4.3. Mise en suspension des cellules (MRC5 et MDCK) 

  • Ajouter, à l’aide d’une pipette graduée stérile, 5 mL de milieu MEM contenant 10% de sérum de veau foetal.
  • A l'aide de la pipette qui vient de servir, émulsionner doucement les cellules en répétant des aspirations-refoulements et en inondant bien la surface où se trouvait le tapis cellulaire. Le but est d'obtenir des cellules dispersées afin d'éviter la formation d'amas qui donneraient naissance à des microcolonies.

                        2.4.4. Contrôle microscopique et numération des cellules 


L'utilisation du bleu Trypan  tt (manipulation avec des gants) permet de différencier les cellules vivantes des cellules mortes : il pénètre dans les cellules mortes, dont la membrane est altérée et les colore en bleu.

L'utilisation d'un hématimètre permet de compter les cellules pour éventuellement ajuster l'inoculum.

  • Ajouter 0,2 mL de la suspension cellulaire obtenue ci-dessus aux 20 µL de bleu Trypan à 0,4% (dans du PBS) déjà répartis dans un tube à hémolyse. Homogénéiser à la pipette Pasteur, laisser en contact quelques minutes.
  • Déposer une goutte de la suspension colorée sur la lame d'un hématimètre et laisser sédimenter quelques instants avant de compter les cellules vivantes (non colorées) au microscope  (objectif x10).

Montrer la préparation microscopique.
NB: l'observation doit être faite dans les 5 à 15 min qui suivent le mélange, car le bleu Trypan se lie aux protéines en solution et tout devient bleu...

  • Noter le nombre de cellules vivantes par mm3 :………………………………………………..
  • Calculer le nombre de cellules vivantes par mL de suspension cellulaire :

…………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

Exercice d’application :
Lors du repiquage d’une culture cellulaire, on effectue une numération de la suspension au bleu Trypan.

  • Quel est le rôle de ce produit ? Quel type de cellules doit-on compter ?
  • Pour la numération, on a mélangé 0,1 mL de suspension cellulaire et 0,1 mL de bleu Trypan. On a compté 200 cellules dans 1 mm3.

Quel volume de milieu neuf doit-on ajouter, avant répartition, à 8 mL de suspension pour obtenir 200000 cellules par mL ?
…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………

 

2.4.5. Répartir la suspension en fonction du taux de croissance de type cellulaire

 

Chaque nouvelle boîte sera identifiée :
a Identification
a Type cellulaire
a Date

  • MRC5: taux de croissance =1/2: 1 boîte de 25 cm2 permet d'entreprendre la culture de 2 boîtes de 25 cm2.

  • MDCK : taux de croissance = 1/10 : 1 boîte de 25 cm2 permet d’entreprendre la culture de 10 boîtes de 25 cm2.

                                   2.4.6. Contrôle de stérilité 
Ensemencer un BGT (bouillon glucosé tamponné) avec une goutte de suspension pour vérifier sa stérilité.

                                   2.4.7. Incubation 
Incuber :

  • Les cellules à 37°C en atmosphère enrichie en  CO2 (étuve à CO2: 5% CO2, 95% air) : permet d’éviter une alcalinisation du milieu qui pourrait être fatale pour les cellules.
  • Le BGT à 37°C en aérobiose pendant 24 à 48 heures.

2.4.8. Observation des cultures obtenues 

  • Vérifier l'absence de trouble du BGT .
  • Observer les cultures au microscope inversé (objectif x10):

……………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………

Dès que le stade de confluence des cellules est atteint (tapis cellulaire), on peut procéder aux isolements viraux.

3. ISOLEMENTS VIRAUX A PARTIR DE PRODUITS PATHOLOGIQUES

3.1. Prélèvements, préparation des échantillons

Exemple de prélèvement: écouvillonnage naso-pharyngé (noté NP) chez un enfant présentant une éruption papuleuse.

L'écouvillon a été déchargé dans un milieu de transport (milieu tryptose: gélatine, tryptose, glucose, NaCl, disodium phosphate + antibiotiques). Puis centrifugation du tube à 3000-4000 tours.min-1 pendant 20 minutes.

Le produit de centrifugation sera ensemencé.

3.2. Inoculation aux cellules

  • Inoculation suivant le tableau ci-dessous:

 

INOCULUM

 

NP

Milieu tryptosé

Boîte B1

X mL

 

Boîte B2

 

X mL

Tube T1

X mL

 

Tube T2

 

X mL

                                                                              
Les tapis cellulaires de B2 et T2 serviront de témoins de lecture des effets cytopathogènes.

  • Incuber 1 heure (minimum) à 3 heures (si possible) à 37°C sous CO2.
  • Vider le surnageant par retournement des boîtes et tubes et introduire du milieu neuf (MEM à 2% de SVF).
  • Incuber à 37°C sous CO2.

3.3. Lecture des effets cytopathogènes

                        3.3.1. Effets cytopathogènes

L'effet cytopathogène d'un virus est la(les) modification(s) morphologique(s) des cellules infectées par ce virus, visible(s) au microscope inversé (altération du tapis cellulaire).

Cet effet est spécifique de familles virales ou de certains virus:

  • Enterovirus: arrondissement des cellules qui se détachent du support et présentent une grande inclusion (éosinophile) intracytoplasmique qui aplatit et refoule le noyau vers la périphérie de la cellule.
  • Paramyxovirideae: effet cytopathogène de type syncitial.
  • Herpesvirideae:
    • Herpesvirus (HSV): cellules réfringentes, de taille importante, en amas (grappe de raisin).
    • Cytomegalovirus (CMV): cellules réfringentes, en banc de poissons (effet cytopathogène en général long à obtenir).
    • Virus varicelle-zona (VZV): aspect intermédiaire entre HSV et CMV.
  • Adenovirus: formation de rétractions cytoplasmiques donnant un aspect en filet de pêche (maillage).

3.3.2. Observation de cultures infectées et fixées 

Ces cultures (CHU) ont été infectées et fixées à l’acétone (+ PBS).

Cellules MRC5 témoins
(type fibroblastique)

Cellules MRC5 infectées par :

Observations

Adenovirus

Atteinte diffuse : cellules réfringentes, rétractions cytoplasmiques donnant un aspect de "maillage" ("filet de pêche")

Cytomegalovirus (CMV)


Atteinte en foyers : cellules réfringentes, en " banc de poisson "

Herpesvirus

Atteinte en foyers (puis diffuse) :
cellules de plus grande taille, réfringentes en "grappe de raisin"

VZV (virus de la varicelle et du zona)

Atteinte en foyers : cellules de plus grande taille, arrondies

Enterovirus

Atteinte diffuse : cellules plus petites, réfringentes, souvent anguleuses (forme de poire).

 

Creative Commons License
Ce site est mis à disposition sous un contrat Creative Commons.  
Par Brigitte VERON - Collectif Photo-Reims