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TITRAGE DES ANTICORPS ANTI-STREPTODORNASE B (ASD)
ASD-Kit de bioMérieux
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1. PRINCIPE (voir schéma)

On recherche la présence d’anticorps anti-streptodornase B (Ac anti-DNase B = ASD ou ASDOR) dans le sérum du patient suspecté d’infection streptococcique (à streptocoque du groupe A). Dans ce but, on utilise comme antigène la streptodornase B (DNase B), exoenzyme produite par les streptocoques du groupe A et capable de dépolymériser l’ADN.

  • Dans un 1er temps, on met en présence :
    • Des quantités connues et croissantes de DNase B réparties dans les cupules d’une barrette
    • Un volume constant du sérum à titrer.

Pendant l’incubation, si le sérum contient des Ac anti-DNase B, ils se fixent grâce à leurs paratopes sur les épitopes spécifiques de la streptodornase  et neutralisent son activité enzymatique : on parle de réaction de neutralisation de l’activité enzymatique.
Si le sérum ne contient pas d’Ac anti-DNase, la streptodornase n’est pas neutralisée.

  • Dans un second temps, pour révéler la réaction, on ajoute de l’ADN (substrat de la DNase) et un indicateur coloré (bleu de toluidine : bleu en présence d’ADN, rose si l’ADN est hydrolysé). Après incubation :
    • Si le bleu de toluidine vire du bleu au rose : l’ADN a été hydrolysé, il reste donc de l’enzyme active, le sérum ne contient pas d’ASD.
    • Si le bleu de toluidine ne vire pas au rose (reste bleu) : l’ADN n’a pas été hydrolysé, l’enzyme a donc été totalement neutralisée, le sérum contient des ASD.

2. ELEMENTS EN PRESENCE

    • Sérums à tester

Ils doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation.



Le sérum contrôle positif est testé en même temps que les sérums des patients et à l’ouverture de chaque nouveau coffret. Il permet un contrôle de qualité indispensable pour la validation des résultats des patients :

  • Contrôle de la qualité des réactifs du coffret
  • Contrôle de la qualité d’exécution des réactions.
    • Réactifs

3. REALISATION PRATIQUE

    • Matériel nécessaire
  • Support de barrette

  • Couvercles de microplaques adaptés aux supports
  • Pipettes automatiques et cônes correspondants
  • Portoir et tubes à hémolyse à usage unique
  • Etuve ou bain thermostaté à 37°C.
    • Mode opératoire (voir fiche ASD-Kit de bioMérieux)
  • Diluer les sérums à tester au 1/200 dans le tampon : 10µL de sérum+ 1990 µL de tampon
  • Prévoir le nombre de barrettes nécessaires et les placer sur un support
  • Pour chaque sérum, déposer 75 µL de dilution dans chacun des 8 puits d’une barrette
  • Agiter le support 1 min, par tapotement latéral, pour dissoudre la streptodornase
  • Incuber 15 min à 37°C pour que la réaction Ag-Ac puisse avoir lieu
  • Distribuer 75 µL de substrat ADN dans chaque puits des différentes barrettes
  • Agiter doucement le support pour homogénéiser
  • Recouvrir pour éviter la dessiccation, puis incuber:
    • Soit 5 heures à 37°C
    • Soit 3 heures à 37°C, puis une nuit à température ambiante (18-25°C)
    • Soit 30 min exactement puis ajouter dans chaque puits 30 µL d’H2O2 à 0,050% puis incuber 2 heures à 37°C. Pendant cette étape, la streptodornase libre hydrolyse l’ADN.
  • Effectuer la lecture en indiquant la couleur (bleu/violet/rose) dans le tableau de résultats.

4. RESULTATS ET INTERPRETATION

    • Lecture

    • Observation du (des) témoin (s)

La validation du (des) témoin(s) est impérative avant toute interprétation des résultats obtenus avec le sérum à tester.

    • Détermination du titre des sérums 

A partir du repère "ASD" indiqué sur la barrette, noter le dernier puits bleu ou violet : il correspond à la plus grande quantité d’enzyme pouvant être neutralisée par les Ac contenus dans le sérum dilué.

Le tableau ci-dessous donne la correspondance entre le numéro du puits (à partir du repère "ASD" indiqué sur la barrette) et le titre du sérum en U.ASD/mL.

N° du puits

1

2

3

4

5

6

7

8

Titre en U.ASD/mL

100

200

300

400

600

800

1200

≥ 1600

Exemple de résultat :

Remarques:

  • Les titres obtenus pour les sérums d’une série ne peuvent être validés que si le titre trouvé pour le sérum de contrôle, testé avec cette série, est égal à celui indiqué par le fournisseur.
  • Si le titre d’un sérum est supérieur ou égal à 1600 U.ASD/mL, il faut refaire le titrage de ce sérum à partir d’une dilution 1/2000 et multiplier par 10 la valeur donnée par le tableau.
    • Interprétation

En cas de résultat négatif, en fonction du contexte clinique, on peut être amené à rechercher les Ac antistreptolysine O (ASLO), qui permettent un diagnostic plus précoce mais moins spécifique.

 

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Ce site est mis à disposition sous un contrat Creative Commons.  
Par Brigitte VERON - Collectif Photo-Reims

 

 
 
Titrage des anticorps anti-streptodornase B (ASD), ASD-Kit de bioMérieux

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  • Dans un 1er temps, on met en présence :
    • Des quantités connues et croissantes de DNase B réparties dans les cupules d’une barrette
    • Un volume constant du sérum à titrer.

Pendant l’incubation, si le sérum contient des Ac anti-DNase B, ils se fixent grâce à leurs paratopes sur les épitopes spécifiques de la streptodornase  et neutralisent son activité enzymatique : on parle de réaction de neutralisation de l’activité enzymatique.
Si le sérum ne contient pas d’Ac anti-DNase, la streptodornase n’est pas neutralisée.

  • Dans un second temps, pour révéler la réaction, on ajoute de l’ADN (substrat de la DNase) et un indicateur coloré (bleu de toluidine : bleu en présence d’ADN, rose si l’ADN est hydrolysé). Après incubation :
    • Si le bleu de toluidine vire du bleu au rose : l’ADN a été hydrolysé, il reste donc de l’enzyme active, le sérum ne contient pas d’ASD.
    • Si le bleu de toluidine ne vire pas au rose (reste bleu) : l’ADN n’a pas été hydrolysé, l’enzyme a donc été totalement neutralisée, le sérum contient des ASD.

2. ELEMENTS EN PRESENCE

    • Sérums à tester

Ils doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation.



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  • Contrôle de la qualité des réactifs du coffret
  • Contrôle de la qualité d’exécution des réactions.
    • Réactifs

3. REALISATION PRATIQUE

    • Matériel nécessaire
  • Support de barrette

  • Couvercles de microplaques adaptés aux supports
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  • Etuve ou bain thermostaté à 37°C.
    • Mode opératoire (voir fiche ASD-Kit de bioMérieux)
  • Diluer les sérums à tester au 1/200 dans le tampon : 10µL de sérum+ 1990 µL de tampon
  • Prévoir le nombre de barrettes nécessaires et les placer sur un support
  • Pour chaque sérum, déposer 75 µL de dilution dans chacun des 8 puits d’une barrette
  • Agiter le support 1 min, par tapotement latéral, pour dissoudre la streptodornase
  • Incuber 15 min à 37°C pour que la réaction Ag-Ac puisse avoir lieu
  • Distribuer 75 µL de substrat ADN dans chaque puits des différentes barrettes
  • Agiter doucement le support pour homogénéiser
  • Recouvrir pour éviter la dessiccation, puis incuber:
    • Soit 5 heures à 37°C
    • Soit 3 heures à 37°C, puis une nuit à température ambiante (18-25°C)
    • Soit 30 min exactement puis ajouter dans chaque puits 30 µL d’H2O2 à 0,050% puis incuber 2 heures à 37°C. Pendant cette étape, la streptodornase libre hydrolyse l’ADN.
  • Effectuer la lecture en indiquant la couleur (bleu/violet/rose) dans le tableau de résultats.

4. RESULTATS ET INTERPRETATION

    • Lecture

    • Observation du (des) témoin (s)

La validation du (des) témoin(s) est impérative avant toute interprétation des résultats obtenus avec le sérum à tester.

    • Détermination du titre des sérums 

A partir du repère "ASD" indiqué sur la barrette, noter le dernier puits bleu ou violet : il correspond à la plus grande quantité d’enzyme pouvant être neutralisée par les Ac contenus dans le sérum dilué.

Le tableau ci-dessous donne la correspondance entre le numéro du puits (à partir du repère "ASD" indiqué sur la barrette) et le titre du sérum en U.ASD/mL.

N° du puits

1

2

3

4

5

6

7

8

Titre en U.ASD/mL

100

200

300

400

600

800

1200

≥ 1600

Exemple de résultat :

Remarques:

  • Les titres obtenus pour les sérums d’une série ne peuvent être validés que si le titre trouvé pour le sérum de contrôle, testé avec cette série, est égal à celui indiqué par le fournisseur.
  • Si le titre d’un sérum est supérieur ou égal à 1600 U.ASD/mL, il faut refaire le titrage de ce sérum à partir d’une dilution 1/2000 et multiplier par 10 la valeur donnée par le tableau.
    • Interprétation

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