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SÉROTYPAGE DES SALMONELLA
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1. QUAND LE PRATIQUER?


Un sérotypage est effectué systématiquement, dès que l'identification biochimique révèle le genre Salmonella.

2. EN QUOI CONSISTE-T-IL?


Le sérotypage des Salmonella consiste, grâce à des réactions d'agglutination active directe sur lame, à:

  • Identifier les antigènes O de ces bactéries  afin de déterminer le groupe auquel elles appartiennent
  • Puis identifier les antigènes H afin de déterminer précisément le sérovar.

3. COMMENT LE PRATIQUER?


Le sérotypage des Salmonella est réalisé grâce à une technique d'agglutination active directe sur lame, mettant en jeu les bactéries à tester avec différents antisérums. Il nécessite:

  • Une culture pure de la souche de Salmonellasur gélose non sélective (la recherche des antigènes H nécessite une gélose coulée en pente qui présentera une zone humide où les antigènes H sont bien exprimés: GNi ou Kligler)
  • Des antisérums spécifiques obtenus par immunisation d'animaux:
      • sérum anti-Vi
      • sérums anti-O mélanges: OMA (anticorps des groupes O:2(A), O:4(B), O:9(D), O:3(E) , O:21(L)), OMB (anticorps des groupes O:8(C), O:11(F), O:13(G), O:6,14(H)) et OMC (anticorps des groupes O:16(I), O:17(J), O:18(K), O:21(L), O:28(M), O:30(N), O:35(O), O:38(P)) qui agglutinent plus de 95 % des sérotypes
      • sérums anti-O mono, di ou trivalents
      • sérums anti-H polyvalents ou monovalents.

NB: le coût des sérums est élevé (voir tableau page 3).

  • Un extrait du tableau de Kauffmann-White qui regroupe les différents sérotypes rencontrés en pathologie. Voir pages 3, 4, et 5.           

Technique

  • Déposer une goutte d'antisérum sur une plaque ou lame de verre parfaitement propre
  • Emulsionner, à la pipette ou à l’aide d’un agitateur jetable, un peu de culture bactérienne prélevée sur gélose non sélective de façon à obtenir un trouble homogène dans la goutte (pour l'identification des antigènes H, prélever l'eau de condensation présente à la base de la gélose inclinée)
  • Agiter la lame par mouvements lents et circulaires
  • Observer l'apparition d'agglutinats: fins, granulaires et difficiles à dissocier dans le cas des antigènes O et Vi; floconneux, faciles à dissocier dans le cas des antigènes H (s'aider éventuellement d'un fond noir pour une meilleure visualisation des agglutinats).

 

 

 

F  Sécurité
On travaillera de préférence avec des gants, sans bec Bunsen (asepsie non nécessaire, mais risque de souillure des mains lors des mouvements de rotation des lames et de contamination par voie orale).


4. CONDUITE DU SÉROTYPAGE


1ère  étape: test en eau physiologique
Tester la souche en eau physiologique.

  • S'il n'y a pas agglutination, la souche n'est pas auto-agglutinable et on peut poursuivre le sérotypage.
  • S'il y a agglutination, la souche est auto-agglutinable. Il faut la repiquer et recommencer le sérotypage.

 2ème  étape: recherche de l'antigène d'enveloppe avec l'antisérum Vi

  • S'il n'y a pas d'agglutination, poursuivre le sérotypage.
  • S'il y a agglutination, on s'oriente vers les souches susceptibles de porter l'antigène Vi: S. Typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin. Détruire l'antigène Vi par chauffage 10 min à 100°C pour poursuivre.

 3ème  étape: détermination du groupe par identification des antigènes O majeurs

  • Tester d'abord les antisérums O mélanges: OMA et OMB.
    • Si agglutination dans OMA (inutile de tester OMB si l'agglutination est franche): conclure que la souche appartient à l'un des groupes O:2(A), O:4(B), O:9(D), O:3(E), O:21(L).
    • Si absence d'agglutination dans OMA, tester OMB: une agglutination avec OMB permet de conclure que la souche appartient à l'un des groupes O:8(C), O:11(F), O:13(G), O:6,14(H).
  • Tester ensuite les antisérums mono- ou divalents par ordre de fréquence des groupes.
    • Si agglutination dans OMA:
      • Rechercher d'abord l'antigène majeur du groupe O:4 (B), donc tester l'antisérum O4,5 (seul antisérum commercialisé)
      • Puis rechercher, en l'absence d'agglutination, l'antigène majeur du groupe O:9 (D1) avec l'antisérum O9 
      • Puis rechercher, en l'absence d'agglutination, l'antigène majeur du groupe O:3,10 (E1) avec l'antisérum O3,10,15 
      •  Puis rechercher, en l'absence d'agglutination, l'antigène majeur du groupe O:2 (A) avec l'antisérum O1,2. 
    • Si agglutination dans OMB:
      • Rechercher d'abord l'antigène majeur du groupe O:8 (C2-C3) en testant l'agglutination dans le sérum O8
      • Puis, si nécessaire, tester le groupe O:7 (C1) avec le sérum O7.

4ème  étape: détermination du sérotype par identification des antigènes H

Tester les antisérums H adaptés au groupe déterminé précédemment en testant la phase 1 puis la phase 2 (phase 1 la plus fréquente) :

  • Sérums H mélanges testés en fonction des antigènes H possibles
  • Puis sérums H monovalents en fonction des résultats des mélanges H et dans l’ordre de fréquence des sérovars.

NB: si les sérums à disposition ne permettent pas une identification complète et/ou si des difficultés d'identification subsistent, envoyer la souche au centre de référence des salmonelles à l'Institut Pasteur qui assure le suivi des salmonelloses.

TABLEAU DE KAUFFMANN-WHITE

Il répertorie tous les sérovars de Salmonella (plus de 2000 !), établissant leur classification en groupes désignés par « O : numéro ».

Les groupes sont définis par des antigènes O.
Ainsi:

  • Le groupe O:2 regroupe les salmonelles comportant l'antigène O2 (anciennement groupe A)
  • Le groupe O:4 regroupe les salmonelles comportant l'antigène O4 (anciennement groupe B)
  • Le groupe O:9 regroupe les salmonelles comportant l'antigène O9 (anciennement groupe D)

...

Ces antigènes O, spécifiques de groupe, sont appelés antigènes O majeurs (en caractères gras dans les tableaux).
Les autres antigènes O, présents chez un grand nombre de sérovars, sont appelés antigènes O accessoires (ex: O1, O12...).

Les sérovars sont définis par les antigènes H.

Les antigènes H peuvent exister sous deux phases:

  • Phase 1, dite spécifique   H: a, b, c...
  • Phase 2, dite non spécifique   H: 1, 2, 5...

Une bactérie présente ses antigènes H sous une seule phase, 1 ou 2; mais au sein d'une culture pure, il peut y avoir des bactéries en phase 1, d'autres en phase 2 (la phase 1 est plus fréquente que la phase 2).

Lorsqu'une phase n'est pas représentée, il est nécessaire de réaliser une inversion de phase afin de l'obtenir en quantité suffisante. Cela consiste à faire cultiver la salmonelle dans une gélose molle, additionnée d'anticorps de la phase à éliminer et de recueillir, à distance du dépôt, les salmonelles mobiles qui possèdent des flagelles de la phase non agglutinée par les anticorps du milieu: c'est le test de Sven-Gard.

Antisérums commercialisés (les plus courants)

Sérum Vi

Sérums O

O mélanges
(51,25 € HT le flacon de 60 tests)

OMA : anticorps des groupes O:2(A), O:4(B), O:9(D), O:3(E) , O:21(L)

OMB : anticorps des groupes O:8(C), O:11(F), O:13(G), O:6,14(H)

OMC : anticorps des groupes O:16(I), O:17(J), O:18(K), O:21(L), O:28(M), O:30(N), O:35(O), O:38(P)

O monovalents : 1,2 - 4,5 - 6,7,8 – 7 – 8 – 9 - 3,10,15 – 15 - 1,3,19 – 11 - 13,22,23 - 6,14,24
(31 à 50 € HT le flacon de 60 tests)

Sérums H

H mélanges
(51,25 € HT le flacon de 60 tests)

H1 = 1, 2, 5, 6 , 7, z6

HL = l, v, w, z13, z28, z40

H:En = e, n, x, z15

HZ4 = z4, z23, z24, z32

HG = f, g ,p, m, s, t

H monovalents : a – b – c – dg,m – g,p – hi – k – m – p – r – v – w – x – y –z –z10 – z15 – 2 – 5 – 6 -7
(31 à 108 € HT le flacon de 60 tests)

EXTRAIT DU TABLEAU DE KAUFFMANN-WHITE
FORMULES ANTIGÉNIQUES DES SÉROVARS DE Salmonella enterica LES PLUS FRÉQUEMMENT RENCONTRÉS EN FRANCE

 

- Les facteurs entre crochets ([ ]) peuvent être absents sans pour autant modifier le résultat du sérotypage
- Les facteurs O 1, 27, 14, 15 sont liés à une conversion bactériophagique (donc peuvent être absents).

- Les fréquences sont en constante évolution…Celles indiquées sont fournies par le Rapport d’activités annuel du Centre National de Référence des Salmonelles (Institut Pasteur) de 2009 (classement des 19 sérotypes les plus fréquemment isolés) :

http://www.pasteur.fr/ip/resource/filecenter/document/01s-00004f-0re/ra-cnr-salm-2009.pdf

Groupe

Classement selon la
fréquence
(en France,
en 2009)

Sérovars

Antigène O

Antigène H
Phase 1

Antigène H
Phase 2

O:2
(A)

18

S. Paratyphi A

1,2,12

a

[1,5]

 

O:4
(B)

1

S. Typhimurium

1,4,[5],12

i

1,2

3

S. Typhimurium
(variant monophasique)

1,4,[5],12

i

-

6

S. Derby

1,4,[5],12

f,g

1,2

13

S. Saint Paul

1,4,[5],12

e,h

1,2

16

S. Agona

1,4,12

f,g,s

-

17

S. Bredeney

1,4,12,27

l,v

1,7

19

S. Brandenburg

1,4,12

l,v

e,n,z15

 

S. Paratyphi B

1,4,[5],12

b

1,2

 

S. Heidelberg

1,4,[5],12

r

1,2

 

S.Schwarzengrund

1,4,12,27

d

1,7

 

S. Coeln

4,[5],12

y

1,2

 

S. Wien

1,4,12,27

b

l,w

 

S. Abortusovis

4,12

c

1,6

 

S. Stanley

1,4,[5],12,27

d

1,2

 

S. Indiana

1,4,12

z

1,7

 

4,12:d:

4,12

d

-

 

S. Duisburg

1,4,12,27

d

e,n,z15

 

4,5,12:b:

4,5,12

b

-

 

S. Chester

1,4,[5],12

e,h

e,n,x

 

S. Reading

1,4,[5],12

e,h

1,5

 

S. Sandiego

4,[5],12

e,h

e,n,z15

 

S. Kisangani

1,4,[5],12

a

1,2

 

S. Abony

1,4,[5],12,27

b

e,n,x

 

S. Stanleyville

1,4,[5],12,27

z4,z23

1,2

 

S. Essen

4,12

g,m

-

Groupe

Fréquence

Sérovars

Antigène O

Antigène H
Phase 1

Antigène H
Phase 2

O:7
(C1)

8

S. Infantis

6,7

r

1,5

11

S. Virkow

6,7

r

1,2

15

S. Montevideo

6,7

g,m,(p),s

1,2,7

 

S. Braenderup

6,7

e,h

e,n,z15

 

S. Livingstone

6,7,14

d

l,w

 

S. Mbandaka

6,7

z10

e,n,z15

 

S. Thompson

6,7

k

1,5

 

S. Ohio

6,7,14

b

l,w

 

S. Rissen

6,7,14

f,g

-

 

S. Oranienburg

6,7

m,t

-

 

S. Tennessee

6,7,14

z29

1,2,7

 

S. Isangi

6,7

d

1,5

 

S. Bareilly

6,7

y

1,5

O:8
(C2-C3)

4

S. Hadar

6,8

z10

e,n,x

7

S. Newport

6,8

e,h

1,2

9

S. Kentucky

8,20

i

z6

 

S. Corvallis

8,20

z4, z23

[z6]

 

S.Bovismordificans

6,8

r

1,5

 

S. Paratyphi C

6,7,Vi

c

1,5

 

S. Manhattan

6,8

d

1,5

 

S. Blockley

6,8

k

1,5

 

S. Muenchen

6,8

d

1,2

 

S. Kottbus

6,8

e,h

1,5

 

S. Lichtfield

6,8

l,v

1,2

 

S. Emek

8,20

g,m,s

-

 

  S. Enteritidis 1,9,12 g,m -

O:9
(D1)

2

S. Enteritidis

1, 9, 12

g,m

-

5

S. Typhi

9,12,Vi

d

-

10

S. Panama

1,9,12

l,v

1,5

12

S. Napoli

1,9,12

l,z13

e, n, x

14

S. Dublin

1,9,12,Vi

g,p

-

 

S. Gallinarum

1,9,12

-

-

 

9,12 :l,v

9,12

l,v

-

 

S. Miami

1,9,12

a

1,5

 

S. Goettingen

9,12

l,v

e,n,z15

 

S. Javiana

1,9,12

l,z28

1,5

 

O:3,10
(E1)

 

S. Give

3,10

l,v

1,7

 

S.Anatum

3,10

e,h

1,6

 

S. London

3,10

l,v

1,6

 

S. Orion

3,10

y

1,5

 

S. Meleagridis

3,10

e,h

l,w

 

S. Muenster

3,10

e,h

1,5

 

S. Uganda

3,10

l,z13

1,5

 

S. Lexington

3,10

z10

1,5

 

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Par Brigitte VERON - Collectif Photo-Reims