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IDENTIFICATION DES CHAMPIGNONS
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1. Identification des champignons filamenteux

                        1.1. Généralités
Elle est basée sur les caractères macroscopiques et microscopiques des champignons obtenus en culture pure.

  • Caractères macroscopiques
    • Délai de culture
    • Aspect de la colonie: plate ou surélevée..., plane, plissée ou cratériforme..., glabre, plâtreuse, poudreuse, granuleuse, duveteuse ou floconneuse...
    • Couleur du revers, existence de crêtes ou arborisations en profondeur de la gélose.
  • Caractères microscopiques: examen des organes fongiques.

Noter la présence, l'abondance et la forme des filaments mycéliens, arthrospores, microspores (microconidies), macrospores (macroconidies), formations ornementales (vrilles, organes pectinés, organes nodulaires, chandeliers faviques).

                        1.2. Identification des Aspergillus

  • Aspect macroscopique:

Il peut être réalisé sur milieu de Czapek qui favorise la croissance et la sporulation de la plupart des Aspergillus quand il est additionné de 1% de liqueur de macération de maïs, ou sur tout autre milieu permettant la culture d’Aspergillus (gélose Sabouraud, gélose Sabouraud + CMP) : on décrira la surface et le revers.

  • Aspect microscopique

Les Aspergillus sont reconnaissables à l'examen microscopique par les filaments septés portant des têtes aspergillaires (spécifiques du genre Aspergillus) qui sont des vésicules à l'extrémité de conidiophores qui donnent naissance à des spores externes allongées (stérigmates ou phialides) qui à leur tour donnent des conidies.

 

Tête unisériée

(phialides insérées directement sur la vésicule)

Tête bisériée

(phialides insérées sur la vésicule par des métules)


Identification

  • Mise en évidence de tête aspergillaire (vésicule (± métules) + phialides + conidies) agenre Aspergillus
  • Diagnostic d’espèce : aspect des colonies à maturité, taille et forme de la vésicule, disposition des phialides, aspect et taille du conidiophore, taille et forme des conidies (voir tableau page suivante).

    1.3. Identification des autres champignons filamenteux opportunistes 

 

Habitat/pouvoir pathogène

Macroscopie

Microscopie

Penicillium
Photos/schémas : fichier mycologie page 43

-Saprophyte de l’environnement
-Utilisation dans l’industrie agro-alimentaire (affinage du fromage et du saucisson) et pharmaceutique
-Rares espèces incriminées en pathologie humaine : P.marneffei responsable d’infections systémiques chez les individus immuno-déprimés (Asie du Sud Est)

-Surface poudreuse, blanche à bleu-vert
-Revers incolore à jaunâtre.

-Mycélium septé (eumycélium)
-Conidiophore en ²pinceau²
-Phialides à l’extrémité des ramifications
-Conidies rondes ou ovoïdes, lisses ou rugueuses, hyalines ou colorées, en longues chaînes

Mucor

Photos/schémas : fichier mycologie page 41

-Saprophyte du sol, des fruits et graines de céréales
-mycose rhinocérébrale
-mycose cutanée chez les grands brûlés
-mycose pulmonaire chez les leucémiques

-Surface cotonneuse, blanc beige à brun
-Revers incolore.

-Sporocystes (=sporanges) bruns
-Sporocystophore
(=sporangiophore) non ramifié
-Columelle (=dilatation de la partie apicale du sporocystophore) ovoïde ou cylindrique
-Spores ovoïdes, lisses ou rugueuses

Geotrichum
Photos/schémas : fichier mycologie page 40

-Saprophyte des plantes et du tube digestif de l’homme
-Atteintes respiratoires, digestives et buccopharyngées sur terrain débilité

-Surface cireuse ou duveteuse, blanche
-Revers incolore.

- Mycélium septé (eumycélium)
-Arthrospores à paroi épaisse

 

 

 

Aspergillus
fumigatus

Aspergillus
flavus

Aspergillus
niger

Aspergillus
terreus

Aspergillus
nidulans

Croissance

Délai culture

24 à 48 h à 37°C

2 à 3 jours

2 à 3 jours

3 à 5 jours

3 à 5 jours

Température optimale

40-42°C
(culture jusqu’à 57°C)

37°C

25-30°C
(culture à 42°C)

25-30°C
(culture à 37°C)

25-30°C
(culture à 37°C)

Aspect macroscopique

Recto
(surface)

Colonies blanches, puis bleu-vert, puis vert foncé à gris noirâtre

Colonies duveteuses à poudreuses, d’abord blanches, puis jaunes, puis vert-jaune

Colonies d’abord blanches, puis jaunes et enfin granuleuses noires

Colonies duveteuses à poudreuses, de teinte beige à brun-noisette ou canelle

Colonies duveteuses à poudreuses, en général vert foncé ou vert cresson, jaunâtres pour les souches productrices de cléistothèces

Verso
(revers)

Incolore, jaune, vert ou brun-rouge suivant les souches

Incolore, rosé ou brun-rouge foncé

Incolore à jaune pâle

Jaune à brun-orange

Rougeâtre, pourpre

Aspect microscopique

Tête aspergillaire

Unisériée, en colonne compacte, assez grande (jusqu’à 100 µm de long)

Unisériée ou bisériée, petite en colonne ou grande et radiée
(300 à 400 µm de long)

Bisériée radiée, noire à maturité

Bisériée, en colonne évasée (aspect d’éventail)

Bisériée, en colonne, courte et compacte

Vésicule

hémisphérique
(20 à 30 µm)

sphérique (25 à 45 µm)

globuleuse (45 à 75 µm)

globuleuse

sphérique

Phialides

Directement portées par la vésicule, dressées

Directement portées par la vésicule (unisériée) ou portées par des métules (bisériées)

Insérées sur la vésicule par des métules (bisériée)disposées sur tout le pourtour de la vésicule

Portées par des métules insérées sur toute la partie supérieure de la vésicule

Portées par des métules insérées sur la partie supérieure de la vésicule

Conidies

Globuleuses, vertes, échinulées, petites (2,5 à 3 µm de diamètre)

Globuleuses à subglobuleuses, vert pâle, échinulées (3,5 à 4,5 µm de diamètre)

Globuleuses, brunes, échinulées, souvent disposées en chaîne(3,5 à 5 µm de diamètre)

Globuleuses à légèrement elliptiques, lisses, petites (6-7 µm)

Rondes, vertes échinulées, souvent disposées en chaînes
(3 à 3,5 µm)

Conidiophore

Court (300 µm), lisse et incolore, évasement progressif au sommet

Long(1 à 2,5 mm), hyalin, verruqueux avec des aspérités

Lisse, hyalin ou brunâtre dans sa moitié supérieure, très long (1,5 à 3 mm)

Lisse, incolore (100 à 250 µm de long)

Brun, lisse, sinueux, très petit (75 à 100 µm)

Schéma de la tête aspergillaire

 

                        1.4. Identification des dermatophytes 

Définition :

  • Champignons filamenteux
  • Parasites exclusifs de la kératine (peau, ongles, follicules pileux)
  • Ne présentant aucune affinité pour les muqueuses et les tissus profonds
  • Sensibles à la griséofulvine

Trois genres :

  • Genre Microsporum
  • Genre Epidermophyton
  • Genre Trichophyton
    • Aspect macroscopique : sur Sabouraud + chloramphénicol (+cycloheximide). On décrira la surface et le revers :
      • Couleur des colonies au recto et verso
      • Forme des colonies : rondes, étoilées…
      • Relief des colonies : plates, plissées…
      • Caractéristiques de la surface : duveteuse, poudreuse, granuleuse, glabre…
      • Taille des colonies : réduite ou étendue.
      • Pigment diffusant dans la gélose.
    • Aspect microscopique : les éléments caractéristiques des dermatophytes sont les suivants :

Filaments mycéliens cloisonnés

En "raquette"

En "bambou"

Chlamydospores

Microconidies (unicellulaires) : rondes ou piriformes

Macroconidies (pluricellulaires et cloisonnées transversalement)

  • Paroi lisse chez Trichophyton et Epidermophyton
  • Paroi rugueuse chez Microsporum


 

 

Macroconidies lisses
(genre Trichophyton et Epidermophyton)

 

 

 

Macroconidies échinulées
(genre Microsporum)

Ornementations

Organe pectiné (en forme de peigne)

Ex : Microsporum audouinii, Trichophyton schoenleinii

Organe nodulaire
(en forme de nœud)

Ex : Trichophyton schoenleinii

Chandelier favique

Ex : Trichophyton schoenleinii

Clou favique

Ex : Trichophyton schoenleinii

vrille

Ex : Microsporum persicolor, Trichophyton mentagrophytes

    • Différenciation des principaux genres et espèces de dermatophytes d’après les examens macroscopique et microscopique

 

macroscopie

microscopie

genres

espèces

parasitisme pilaire

délai culture

surface

revers

macroconidies

microconidies

ornementation

Epidermophyton
Attaque la peau, les ongles

E. floccosum

 

Rapide
(5 à 6 jours)

Poudreuse, jaune-verdâtre

Jaunâtre, chamois

Nombreuses, lisses (parfois échinulées), en "régime de bananes"

 

Chlamydospores

Microsporum

Attaque la peau, les ongles, les cheveux, les poils

M. canis

Microspori-que

Rapide
(5 à 6 jours)

Duveteuse, blanche, aspect étoilé

Pigment jaune-orangé

En "quenouille", échinulées (parois et cloisons épaisses)

Inconstantes, piriformes

Mycélium en raquette

M. gypseum

Favique ou endo-ectothrix

Rapide
(5 à 6 jours)

Plâtreuse, beige puis chamois

Chamois foncé

En "cocon", nombreuses, échinulées

Rares, piriformes

 

M. langeronii

Microspori-que

Lent
(8 à 10 jours)

Duveteuse, blanche à grise

Beige saumoné

Rares, déformées, paroi épaisse et échinulée

piriformes

Chlamydospores, mycélium en raquette, organes pectinés

M. persicolor

 

Rapide
(5 à 6 jours)

Aspect de feutre, blanche à beige puis rosée

Rose-lilas

Assez rares, lancéolées, finement échinulées (paroi mince)

Nombreuses, arrondies, en "bout d’allumette"

Vrilles, filaments articulés à angle droit

Trichophyton

Attaque la peau, les ongles, les cheveux, les poils

T. mentagro-phytes

microïde

Rapide
(5 à 6 jours)

Poudreuse, duveteuse, blanc-crème

Incolore ou brun-rougeâtre

Assez rares, en massue, lisses, parois minces

Nombreuses, arrondies, disposées en buisson

Vrilles, filaments articulés à angle droit

T. rubrum

Très rare, endothrix ou ecto-endothrix

Rapide
(6 à 7 jours)

Duveteuse, blanc-crème ou violacée

Incolore ou brun

En général très rares, lisses allongées, parois minces

Inconstantes, piriformes, en acladium

Organes triangulaires

T. schoenleinii

favique

Très lent (15 jours)

Cireuse, jaunâtre

jaunâtre

 

 

Chlamydospores, clous et chandeliers faviques

T. soudanense

endothrix

Lent
(10 à 15 jours)

Glabre et plissée, aspect étoilé, couleur "abricot sec"

rouille

Très rares, lisses

Très rares, piriformes

"fil de fer barbelé"

T. tonsurans

endothrix

Lent
(10 à 15 jours)

Poudreuse ou veloutée, blanche à jaune soufre

Beige ou rouge

Rares, lisses, allongées, parois minces

Nombreuses, piriformes

chlamydospores

T. verrucosum

mégaspore

Très lent (3 semaines)

Verruqueuse, blanc-crème

brun

 

 

Chlamydospores, filaments toruloïdes (avec renflements et étranglements)

T. violaceum

endothrix

Lent
(10 à 15 jours)

Bombée, glabre, violette (parfois blanche)

violet

 

 

Filaments toruloïdes (avec renflements et étranglements)


  • Orientation de l’identification

Remarques :

  • Les caractéristiques morphologiques font parfois défaut, surtout dans les primocultures, imposant le repiquage sur des milieux plus propices à la pigmentation des colonies et à la sporulation.
  • Le diagnostic in fine est le résultat de la confrontation des différents arguments, épidémiologiques, cliniques et morphologiques.

2. Identification des levures d’intérêt médical


Les principaux genres sont :

  • Genre Candida
  • Genre Cryptococcus
  • Genre Rhodotorula
  • Genre Trichosporon

                  2.1. Différenciation des genres


Genres

morphologie

Candida

 

 

  • Levures bourgeonnantes, ovalaires (3 x 6 µm), non capsulées, à bourgeonnement multipolaire

 

 

  • Filaments :pseudomycélium, eumycélium avec blastospores

 

Cryptococcus

 

  • Levures rondes ou ovales (4 µm) à bourgeonnement multipolaire, capsulées
  • Absence de mycélium

   

Rhodotorula

  • Levures rondes ou ovales à bourgeonnement multipolaire
  • Absence de mycélium et capsule
  • Production de pigments caroténoïdes qui donnent aux colonies une couleur rose à rouge

 

Trichosporon

  • Levures ovalaires à bourgeonnement multipolaire, non capsulées
  • Filaments arthrosporés

2.2. Différenciation des espèces du genre Candida


                             2.2.1. Identification de Candida albicans/Candida dubliniensis


Rappel : Candida dubliniensis est une nouvelle espèce de levures, phylogénétiquement très proche de Candida albicans et identifiée spécifiquement par des techniques de biologie moléculaire ou un test d’agglutination (Bichro-dubli).
Voir tableau pages suivantes : on choisira l’un des tests proposés.

 

Principe

Technique

Lecture et interprétation

Test de blastèse ou test de filamentation en sérum

 

Candida albicans et Candida dubliniensis sont les seules espèces qui produisent des tubes germinatifs en 3 heures à 37°C, dans un milieu pour blastèse ou dans du sérum. Au-delà de 4 heures, la germination n’est plus spécifique de Candida albicans/Candida dubliniensis.
F  2% des souches de C.albicans/ Candida dubliniensis ne produisent pas de tubes germinatifs

 

-Réaliser une suspension de levures d’opacité à peine visible dans 1 mL de sérum frais, humain ou animal, ou dans 1 mL de milieu pour blastèse.

-Agiter.

-Incuber 3 heures à 37°C (maximum 4 heures)

- Observer à l’état frais entre lame et lamelle.

-Observation de tubes germinatifs
-Orientation vers C.albicans/Candida dubliniensis, seules espèces capables de former des tubes germinatifs en 3 heures à 37°C

-Observation de pseudomycélium (base étranglée)
-Orientation vers une espèce autre que C.albicans ou Candida dubliniensis.

F  TUBE GERMINATIF ≠ PSEUDOMYCELIUM
Tube germinatif : base non étranglée                                                   Pseudomycélium : base étranglée

Test de chlamydo-sporulation
sur milieu PCB (Pomme de terre, Carotte, Bile) ou RAT (Riz, Agar, Tween)

Ensemencée sur des milieux spéciaux riches en polyosides et contenant des molécules créant des conditions peu favorables (bile, tween) et en semi-anaérobiose, Candida albicans et Candida dubliniensis sont les seules espèces du genre Candida à produire des chlamydospores en 24 à 48 heures, à température ambiante (ou à 28°C).
F 5 % des souches de Candida albicans/ Candida dubliniensis ne produisent pas de chlamydospores.

-Sur un milieu coulé en boîte de Pétri (PCB ou RAT), faire un quadrillage à la surface de la gélose à l’aide d’une pipette chargée de suspension à tester
-recouvrir d’une lamelle

-Incuber 24 à 48 heures à température ambiante (ou à 28°C)
-Examiner directement le milieu sous le microscope (objectif x40)

Levures bourgeonnantes : n’appartiennent pas au genre Candida

Levures bourgeonnantes + pseudomycélium + blastospores : levures du genre Candida, orientation vers une espèce autre que C. albicans/C.dubliniensis


Levures bourgeonnantes + pseudomycélium + blastospores + chlamydospores (spores de 6 à 12 µm, rondes ou ovales, à double contour, très réfringentes) : C.albicans/ C.dubliniensis.

Milieu chromogène :  chromID Candida / Sabouraud Gentamicine Chloramphé-nicol 2 : CAN2/SGC2
(document 2)
ou autre

 

Le milieu CAN2/SGC2 est composé de 2 milieux de culture répartis dans une même boîte de Pétri :

-chromID Candida contient un substrat chromogène permettant la mise en évidence d’une hexosaminidase spécifique de Candida albicans qui donnera des colonies bleues.

-gélose Sabouraud Gentamicine Chloramphénicol 2 : les antibiotiques permettent de sélectionner les levures et les moisissures.

 

 

 

 

 

Isolement (peut être réalisé directement à partir du prélèvement)

Milieu chromID Candida :
-colonies bleues : hexosaminidase + : Candida albicans
-colonies roses : C. tropicalis, C. lusitaniae ou C. kefyr
-colonies blanches : autres espèces

Test de co-agglutination sur lame :
Bichro-latex albicans Fumouze

(document 3)

On utilise des particules de latex sensibilisées avec un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement un antigène pariétal (démasqué par un réactif dissociant contenant des enzymes) des Candida du groupe Candida albicans/Candida dubliniensis. Ces particules de latex sensibilisées, en présence de
Candida albicans ou Candida dubliniensis donneront une agglutination.

Test d’agglutination sur lames à usage unique
(voir document 3)

 

-agglutination : la souche testée est Candida albicans ou Candida dubliniensis

-absence d’agglutination : la souche testée est une espèce différente de Candida albicans et Candida dubliniensis

Remarque : il est possible de différencier ces deux espèces avec le test Bichro-Dubli Fumouze.

    2.2.2. Identification des autres espèces du genre Candida

  • Galerie classique
    • Zymogramme : étude des fermentations sucrées sur milieu CTA (glucose, galactose, maltose, saccharose, lactose, raffinose)
    • Auxanogramme du carbone : utilisation des glucides en milieu aérobie comme unique source de carbone et d’énergie (assimilation des glucides).
  • Microgaleries : deux exemples

 

Incubation

Tests

Api Candida
Document 4

18-24 heures à 37°C

Fermentation des glucides et mise en évidence d’enzymes

Api 20C AUX
Document 5

48 -72 heures à 30°C

Auxanogramme du carbone

 

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Par Brigitte VERON - Collectif Photo-Reims