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ETUDE DE LA SENSIBILITE DES CHAMPIGNONS AUX ANTIFONGIQUES
ANTIFONGIGRAMME PAR LA METHODE DE DIFFUSION EN MILIEU GELOSE
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1. PRINCIPE

Des disques de papier imprégnés avec une concentration déterminée d’antifongique sont déposés à la surface d’un milieu (milieu semi-synthétique pour la 5 fluorocytosine ou milieu casitone pour l’amphotéricine B, nystatine, econazole, clotrimazole, miconazole, ketoconazole) préalablement ensemencé avec un inoculum calibré, préparé à partir d’une culture pure du champignon à tester.
Un gradient de concentration d’antifongique s’établit autour des disques dans la gélose. Après incubation, le diamètre des zones d’inhibition observées autour des disques permet de déduire les CMI des différents antifongiques pour la souche testée et la catégorisation clinique (Sensible, Intermédiaire, Résistant).

2. MILIEUX UTILISES ET DISQUES D’ANTIFONGIQUES TESTES

 

Milieu semi-synthétique
(1 tube de 15 mL a
deux petites boîtes de Pétri)

Milieu casitone
(1 tube de 15 mL a
une grande boîte de Pétri)

Composition
(pour 1L d’eau distillée)

  • Asparagine
  • L-histidine
  • DL-méthionine
  • DL-tryptophane
  • Sulfate d’ammonium
  • Glucose purifié
  • Phosphate de potassium
  • Sulfate de magnésium
  • Chlorure de sodium
  • Vitamines
  • Agar

1,5g
10mg
20mg
20mg
5g
10g
1g
0,5g
0,1g
1,2mg
15g

  • Casitone
  • Extrait levure
  • Citrate de sodium trisodique
  • Phosphate disodique
  • Phosphate monosodique
  • Glucose purifié au charbon
  • Agar

 

pH final = 6,6 ± 0,2

9g
5g
10g
1g
1g
10g
20g

Antifongiques testés

5 fluorocytosine 1 µg (5FC1)

  • Amphotéricine B 100 µg (AB100)
  • Nystatine 100 UI (NY100)
  • Econazole 50 µg (EC 50)
  • Clotrimazole 50 µg (CTR 50)
  • Miconazole 50 µg (MCZ 50)
  • Ketoconazole 50 µg (KET 50)

Les milieux sont coulés en boîte de Pétri. Après solidification, les sécher 15 min à 37°C avant utilisation.

3. TECHNIQUE

    • Préparation de l’inoculum
  • Pour les levures du genre Candida : Préparer un inoculum standardisé correspondant à 105 levures par mL : partir d’une culture pure de 24 heures, obtenue sur milieu d’isolement (gélose Sabouraud chloramphénicol, Sabouraud chloramphénicol gentamicine, par exemple).
    Prélever une öse calibrée à partir d’une colonie isolée et mettre en suspension dans 10 mL d’eau distillée stérile. Bien homogénéiser (cette suspension correspond à 106 levures par mL, environ).
    Effectuer une dilution au 1/10 de cette suspension en introduisant 1 mL (20 gouttes de pipette Pasteur) dans 9 mL d’eau distillée stérile, afin d’obtenir une suspension finale correspondant à 105 levures par mL, environ.
  • Pour Cryptococcus neoformans : L’inoculum doit être de 106 levures par mL : une öse calibrée de culture pure dans 10 mL d’eau distillée stérile.
  • Pour les champignons filamenteux sporulés (comme Aspergillus fumigatus) : 106 spores/mL.
    • Ensemencement et dépôt des disques d’antifongiques
  • Inonder la surface de la gélose avec 3 à 5 mL d’inoculum, puis retirer l’excès de liquide à la pipette.
  • Faire sécher le milieu ensemencé 15 min à 37°C.
  • Appliquer les disques d’antifongiques, soit à la pince, soit à l’aide d’un distributeur de disques :
      • 5FC1 sur le milieu semi-synthétique (à la pince)
      • AB100, NY100, EC50, CTR50, MCZ50, KET50 sur le milieu casitone (distributeur de disques).
  • Laisser les boîtes 30 min à température ambiante (pré-diffusion des antifongiques) avant incubation.
    • Incubation

Incuber à 32°C, en aérobiose :

  • 24 heures pour les levures du genre Candida,
  • 48 heures pour Cryptococcus neoformans.

4. LECTURE ET INTERPRETATION

  • Mesurer précisément les diamètres des zones d’inhibition observées.
  • La correspondance diamètre/CMI/catégorisation clinique (S,I,R) est indiquée dans le tableau ci-dessous :

 

Diamètre de la zone d’inhibition en mm

CMI en µg/mL

Interprétation

Pour les levures
(Candida albicans et autres champignons levuriformes)

5FC1

= 20

1,56

Sensible

20-10

1,56-25

Intermédiaire

= 10

25

Résistant

AB100

> 10

< 1

Sensible

= 10

1

Intermédiaire ou résistant

NY100

>10

-

Sensible

= 10

-

Résistant

EC50, CTR50, MCZ50, KET50
(imidazolés)

= 20

1,56

Sensible

20-10

1,56 – 6,4

Intermédiaire

=10

6,4

Résistant

Pour Aspergillus fumigatus

5FC1

>10

-

Sensible

=10

-

Intermédiaire ou résistant

Remarques :

  • Pour les souches considérées résistantes (diamètre de la zone d’inhibition inférieur à 10 mm), il est conseillé de réaliser une détermination de la CMI ou d’adresser les souches à un laboratoire de référence en mycologie.
  • Pour la 5 fluorocytosine (5FC1), l’existence possible de petites colonies dans la zone d’inhibition correspond à des mutants résistants.
  • Pour les imidazolés, l’évaluation est parfois difficile : certaines souches présentent deux zones d’inhibition :
    • Une grande zone
    • Une zone plus petite avec des petites colonies qui n’apparaissent pas résistantes lorsqu’on évalue à nouveau leur sensibilité.

5. CONTROLE DE QUALITE DU TEST

Le tableau ci-dessous rassemble les limites acceptables des diamètres d’inhibition obtenus par diffusion en milieu gélosé pour les souches de références citées.

 

Limites acceptables des diamètres d’inhibition (mm)

 

Candida albicans DP 3153 A

Candida albicans DP 41R5FC

5FC1

30-38

Résistant

AB100

17-22

17-23

NY100

16-25

17-26

EC50

23-33

25-35

CTR50

18-28

18-30

MCZ50

18-25

20-30

KET50

25-36

29-39

 

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Par Brigitte VERON - Collectif Photo-Reims