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MISE EN EVIDENCE DE STRUCTURES BACTERIENNES PARTICULIERES
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1 . MISE EN EVIDENCE DES SPORES


Certaines espèces bactériennes, en particulier les espèces des genres Bacillus et Clostridium (2 genres de bacilles à Gram positif) sont capables de former des spores quand les conditions deviennent défavorables : température, milieu pauvre…Les spores constituent des formes de résistance. Elles peuvent être mises en évidence :

  • Par les techniques classiques :
      • A l’état frais : les spores apparaissent très réfringentes.
      • A la coloration de Gram : les spores apparaissent sous forme de structures incolores bien délimitées à l’intérieur des bacilles. En effet, les enveloppes sporales interdisent la pénétration des colorants.
  • Technique de BARTHOLOMEW : vert malachite à froid
      • Fixer le frottis par la chaleur : 20 passages dans la flamme (altération des structures pariétales et perméabilisation de la spore).
      • Recouvrir de vert malachite et laisser en contact 10 minutes.
      • Laver à l’eau distillée pendant 10 secondes.
      • Recouvrir le frottis de fuchsine à 0,25% et laisser en contact 10 secondes.
      • Laver à l’eau distillée.
      • Sécher et observer à l’immersion.
  • Technique de BENITO TRUJILLO : vert malachite à chaud
      • Réaliser un frottis et le fixer.
      • Recouvrir d’une solution de vert malachite à 5%.
      • Chauffer jusqu’à émission de vapeurs ; laisser refroidir et chauffer à nouveau. L’opération doit durer 10 minutes au total (rajouter du colorant si nécessaire).
      • Laver soigneusement à l’eau distillée.
      • Recouvrir le frottis de fuchsine basique à 0,25% pendant 1 minute.
      • Laver à l’eau distillée.
      • Sécher et observer à l’immersion.
  • Résultats obtenus avec les techniques au vert malachite

Les spores apparaissent vertes dans des corps bactériens roses

On notera :

  • La forme de la spore

     

spore sphérique spore cylindrique spore ovoïde
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  • La position de la spore

      

spore centrale spore subterminale spore terminale
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  • La déformation éventuelle de la bactérie par la spore

     

spore non déformante   spore déformante
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2. MISE EN EVIDENCE DE LA CAPSULE

La capsule est une couche gélatino-muqueuse, de nature glucidique le plus souvent, présente chez certaines bactéries (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus…) et chez certaines levures (Cryptococcus).
Elle peut constituer un critère d’identification.

Etat frais à l’encre de Chine
L’encre de Chine, suspension de particules de carbone, sert de contrastant.

    • Déposer sur une lame propre, soit une goutte de culture en milieu liquide, soit une goutte d’eau distillée dans laquelle on dissociera une parcelle de colonie.
    • Déposer à côté une petite goutte d’encre de Chine.
    • Recouvrir d’une lamelle (les deux gouttes se mélangent).
    • Examiner la préparation à l’objectif x 40, en particulier dans la zone où l’encre de Chine est diluée sans trop l’être (contraste adéquat).

La capsule apparaît comme un halo clair autour des corps bactériens

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3. MISE EN EVIDENCE DES FLAGELLES (CILS)

  • Pour pouvoir observer des flagelles en microscopie optique, il faut recourir à un artifice qui permet de les épaissir. Les différentes méthodes utilisées, dont la méthode de Rhodes qui sera présentée, utilisent :
        • un mordant qui facilite la coloration,
        • un colloïde qui épaissit les flagelles et les rend visibles.

Les flagelles sont fragiles et la préparation du frottis est délicate

    • Préparation du frottis (utiliser une lame neuve) :

Un frottis réalisé selon la technique classique casserait les flagelles. On laisse couler, sur la lame inclinée à 45° au dessus de la cuve à coloration (mettre de l’eau de Javel dans la cuve), 2 gouttes d’une culture en bouillon (culture jeune : 6 à 12 heures) de la souche à étudier. Laisser sécher.

    • Coloration par la méthode de Rhodes :
      • Recouvrir la préparation de mordant de Rhodes (préparé extemporanément) pendant 3 minutes.
      • Laver soigneusement à l’eau distillée.
      • Recouvrir de nitrate d’argent ammoniacal (préparé extemporanément), chauffé presqu’à ébullition, et laisser agir 3 à 5 minutes.
      • Rincer à l’eau distillée.
      • Sécher et observer à l’immersion.
    • Résultats, observations :

Les corps bactériens apparaissent presque noirs, les flagelles sont teintés en brun plus ou moins foncé

Selon leur disposition autour de la bactérie, on distingue :

Ciliature péritriche :
flagelles répartis sur toute la surface de la bactérie

Ciliatures polaires :
flagelles localisés à un ou deux pôles de la bactérie

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Ex : entérobactérie mobile

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Ciliature polaire monotriche
Ex : Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas spp, Vibrio spp

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Ciliature polaire multitriche
Ex : Pseudomonas fluorescens

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Ciliature amphitriche et multitriche
Ex : Plesiomonas, Helicobacter

 

  • Les flagelles sont aussi visibles en microscopie électronique.
Microscopie électronique à balayage
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Par Brigitte VERON - Collectif Photo-Reims